የተሻሻለ የ canaglipin ጠንካራ ደረጃ ውህደት

caglitide (Cagrilintide) በኖቮ ኖርዲስክ የተሰራ አዲስ ረጅም ጊዜ የሚሰራ ሊፒዲድ አሚሊን አናሎግ ነው። Caglitide 37 አሚኖ አሲዶችን ያቀፈ ነው፣ ሲ- ተርሚናል የአሚድ አይነት ነው፣ እና በኤን ተርሚናል ላይ ያለው α-አሚኖ ቡድን ከ1 γ ግሉ እና 1 eicosanedioic አሲድ (C20diacid) ጋር የተገናኘ ሲሆን የአሚኖ አሲድ ቅደም ተከተል C20 (cycl2-7) ነው። በሜዲላ ኦልጋታታ እና ሃይፖታላመስ ውስጥ የሚገኙትን የተወሰኑ ተቀባይዎችን በማንቃት አሚሊን እርካታን ያመነጫል ፣ ከፕራንዲያል ግሉካጎን ምስጢራትን በመከልከል እና ሃይፖግላይሴሚክ ባልሆኑ ግዛቶች ውስጥ የጨጓራ ​​​​ቅባትን በማዘግየት የደም ውስጥ የግሉኮስ ሆሞስታሲስን ለመቆጣጠር ይረዳል ።ስለዚህ ለክብደት አያያዝ እና ለስኳር ህክምና የአሚሊን አናሎግ እድገት እና ማመቻቸት ትልቅ አቅም አለው። የ68-ሳምንት ምዕራፍ I ክሊኒካዊ ሙከራ ሪፖርት እንደሚያሳየው የካናጊሊቲድ እና ​​ሴልሜግራግሉታይድ የCagriSema የክብደት መቀነስ ውጤት 22.7% ሊደርስ ይችላል፣ እና ጥሩ ደህንነት እና መቻቻል አሳይቷል። በአሁኑ ጊዜ በካናግሊፕቲድ ዝግጅት ሂደት ላይ ጥቂት ሪፖርቶች አሉ, እና አንድ የፈጠራ ባለቤትነት ሂደት አንድ ብቻ ነው. የተለመዱ የጠንካራ-ደረጃ ውህደት ዘዴዎችን በመጠቀም የምርት ሂደቶች ብቻ ተዘግበዋል.

በአሁኑ ጊዜ ረጅም peptides የማዘጋጀት ዘዴዎች በዋነኛነት የጂን ዳግም ውህደት እና ኬሚካላዊ ውህደት ይጠቀማሉ. በጂን መልሶ ማዋሃድ ዘዴ የተገኘው የ C- ተርሚናል ፖሊፔፕታይድ ካርቦክሲል ስለሆነ በሲ ተርሚናል ላይ አንድ ግሊ ማከል አስፈላጊ ነው ፣ እና ከዚያ peptidylglycine a amidation monooxygenase (peptidyl-glycinealpha-amidating monooxygenase ፣PAM) ግላይን ሃይድሮላይዝድ በማድረግ C - ተርሚናል ላይ ለመድረስ። የፒኤም ከፍተኛ ዋጋ ስላለው የ C- ተርሚናል አሚድ ዓይነት ፖሊፔፕታይድ ውህደት በዋነኛነት ጠንካራ ደረጃ የማዋሃድ ዘዴን ይቀበላል። ቀደም ባሉት ጊዜያት, 1-hydroxybenzotriazole/N,N "-diisopropylcarbodiimide ተመሳሳይ ፖሊፔፕቲዶችን ለመዋሃድ እንደ ኮንደንስሲንግ ወኪል ሆኖ ያገለግላል, ነገር ግን ይህ ጥናት 2-oxime cyanoacetate (Oxyma) ለመጠቀም ያሰበ ሲሆን ይህም ዝቅተኛ የፍንዳታ አደጋ, አነስተኛ የዘር ማዛባት የጎንዮሽ ምላሾች እና የተሻለ የመገጣጠም ሂደት ኤኤምኤም ሪሲንክ ሪዚን በዚህ ጊዜ ሪሲንክ ሪሲንክ ሪሲንክ ሪዚን በዚህ ጊዜ ሪሲንክ ሪሲንክ ሪሲንክ ሪዚን በዚህ ጊዜ ውስጥ ውጤታማ በሆነ መልኩ ጥቅም ላይ ይውላል. ተሸካሚ፣ ኦክሲማ እና ዲአይሲ እንደ ኮንደንስሽን ሪጀንቶች ጥቅም ላይ ውለው ነበር፣ Fmoc የተጠበቁ አሚኖ አሲዶች በምላሹ ከረሲኑ ጋር ተጣምረው canaglide resin peptide ለማግኘት፣ ድፍድፍ የተቀነሰ canaglide peptide ለማግኘት በ trifluoroacetic አሲድ የተሰነጠቀ፣ ከዚያም ሳይክሊየስ፣ ተለያይቷል፣ የተጣራ እና ከፍተኛ lyophilaglide.

የምርምር ስርዓቱ ተገቢውን የዝግጅት ሂደት መለኪያዎችን ይመረምራል እና ያመቻቻል, ይህም ለካግላይትስ ጥቅም ላይ ሊውል ይችላል.ማጣቀሻ ለማቅረብ የኢንዱስትሪ ምርት.

የ canagliptide ኬሚካዊ መዋቅራዊ ቀመር

መሰረታዊ መረጃ

የቻይና ስም: Cagliptide

የእንግሊዝኛ ስም:Coglile

ኩባንያ ቁጥር፡-GT-F064

CASአይ፥1415456-99-3

ቅደም ተከተል፡ C20 (ዑደት 2-7)

ሞለኪውላዊ ቀመር:C194H312N54O599S2

ሞለኪውላዊ ክብደት;4409.1

የመዋሃድ ዘዴ

1.Resin Swelling 1.0 g (0.28 mmol) Rink Amide AM ሙጫ በ 0.28 mmol/g የመተካት ዲግሪ ወደ peptide synthesizer ሬአክተር ውስጥ ገብቷል። 15 ሚሊ ሊትር ዲኤምኤፍ ተጨምሯል, እና ድብልቁን ሙሉ በሙሉ ለማበጥ ለ 60 ደቂቃዎች ተነሳ. መፍትሄውን ለማስወገድ ናይትሮጅን ጋዝ ተጠርጓል, እና ቀሪው በ 10 ሚሊር ዲኤምኤፍ (በእያንዳንዱ ጊዜ 2 ደቂቃዎች) ሁለት ጊዜ ታጥቧል.

2.የ Fmoc Deprotection 10 ml ከ 20% ፒፔሪዲን በዲኤምኤፍ መፍትሄ ወደ እብጠት ሬንጅ ተጨምሮ ለ 15 ደቂቃዎች ሁለት ጊዜ ተጨምሮበታል, ከዚያም በማጣራት. ቀሪው በ 10 ሚሊር ዲኤምኤፍ, ሁለት ጊዜ በ 10 ሚሊ ሜትር ሜታኖል እና ሌላ ሁለት ጊዜ በ 10 ሚሊር ዲኤምኤፍ ታጥቧል. አነስተኛ መጠን ያለው ሬንጅ ናሙና ተወስዷል፣ ከ 40 μL የኒንሃይሪን ሬጀንት A እና 40 μL reagent B ጋር ተቀላቅሎ ለ 5 ደቂቃ የFmoc ማስወገጃ ለመገምገም በሚፈላ ውሃ መታጠቢያ ውስጥ እንዲሞቅ ተደርጓል። ሐምራዊ-ጥቁር ሙጫ ቀለም ሙሉ በሙሉ መከላከልን ያመለክታል.

3.የአሚኖ አሲድ ትስስር 189 mg (0.56 mmol, 2 eq) Fmoc-Pro-OH, 120 mg (0.84 mmol, 3 eq) Oxyma እና 106 mg (0.84 mmol, 3 eq) DIC በ 10 mL DMF ውስጥ እና ለ 30 ቀድሞ ነቅቷል. ድብልቁ ወደ ሬአክተር ተላልፏል እና በናይትሮጅን ጥበቃ ስር ምላሽ ይሰጣል. Ninhydrin colorurimetric assay በየ 1 ሰዓቱ ይከናወናል። ቀለም የሌለው ወይም ፈዛዛ ቢጫ ሙጫ ሙሉ በሙሉ መገናኘቱን ያረጋግጣል; አለበለዚያ ምላሹ ቀጥሏል.

4.የተቀሩት አሚኖ አሲዶች ጥምረት ከተጣመረ በኋላ የእናትየው መጠጥ በማጣራት ተወግዷል። ሙጫው አንድ ጊዜ በ 10 ሚሊር ዲኤምኤፍ, ሁለት ጊዜ በ 10 ሚሊ ሜትር ሜታኖል እና ሁለት ጊዜ በ 10 ሚሊ ሊትር ዲኤምኤፍ ታጥቧል. ሁሉም አሚኖ አሲዶች እስኪጣመሩ ድረስ በክፍል 2 እና በክፍል 3 የተገለጹትን ስራዎች በመድገም በ Cagrilintide ቅደም ተከተል መሰረት አሚኖ አሲዶች ከ C-terminus ወደ N-terminus በቅደም ተከተል ተጣምረዋል. ከዚያም ሙጫው በ 10 ሚሊር ዲሲኤም እና በ 10 ሚሊ ሜትር ሜታኖል ለ 3-6 ጊዜ ተለዋጭ ታጥቦ ለ 24 ሰዓታት በተቀነሰ ግፊት ደርቆ 3220 ሚሊ ግራም ቢጫ ሙጫ-ታሰረ peptide. የጠንካራ-ደረጃ ውህደት መንገድ በተያያዘው ምስል ላይ ይታያል.

5. Resin-Bound Peptide Cleavage of Resin-Bound Peptide እና ሂደትን ማሻሻል የአሲድ መቆራረጥ በሚደረግበት ጊዜ ከታለመው ምርት ጋር የተለያዩ ተረፈ ምርቶች ይፈጠራሉ። ስካቬንተሮች በአጠቃላይ ካርቦሃይድሬትን ለማጥመድ ወደ ክላቭጅ ኮክቴል ይታከላሉ. በዚህ ውህድ ውስጥ በተቀበሉት የአሚኖ አሲድ ቅንብር እና የጎን ሰንሰለት መከላከያ ቡድኖች ላይ በመመስረት፣ phenol፣ water፣ TIS፣ PhSMe፣ EDT እና DODT እንደ አጭበርባሪዎች ተመርጠዋል። ፌኖል የ tBu ቡድኖችን ይይዛል እና ከኦክሳይድ ጋር በቀላሉ ምላሽ ይሰጣል። ውሃ tBu እና Boc ቡድኖችን ያስወግዳል; TIS በሚቆረጥበት ጊዜ እንደ ዳይሰልፋይድ ቦንዶች ያሉ ስሱ ቡድኖችን ይቀንሳል። PhSMe Trt እና Pbf መወገድን ያመቻቻል እና የሳይስቴይን የጎን ሰንሰለት ኦክሳይድን ያስወግዳል; EDT የ tBu ቡድኖችን ያስወግዳል እና የሳይስቴይን ኦክሳይድን ይቀንሳል; DODT ከ EDT ያነሰ መጥፎ ሽታ ያለው አማራጭ ነው።

ክሊቫጅ ኮክቴል ማመቻቸት

የማጣራት ዘዴ: እያንዳንዱ ቡድን ክላቭጅ ኮክቴሎች (200 μL) በሰንጠረዥ 1 ላይ እንደተዘረዘረው ተዘጋጅቷል እና በ 20 mg resin-bound peptide በ 20 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ለ 2 ሰዓታት ምላሽ ይሰጣል. ለዝናብ 1.6 ሚሊር ዲዲየል ኤተር ተጨምሯል, ከዚያም በ 9660 × g ለ 5 ደቂቃዎች ሴንትሪፍግሽን ይከተላል. ዝናቡ በሶስት ጊዜ በዲቲል ኤተር ታጥቧል፣ ደርቋል፣ በ 1 ሚሊ ሊትር ውሃ ውስጥ ይቀልጣል እና በ 0.22 μm aqueous PES membrane ማጣሪያ ለ HPLC ትንተና ተጣራ። Chromatographic ሁኔታዎች: YMC C4 የትንታኔ አምድ (4.6 ሚሜ × 250 ሚሜ, 5 μm); የሞባይል ደረጃ A: 0.05% TFA በውሃ ውስጥ; የሞባይል ደረጃ B: 0.05% TFA በ acetonitrile; ቀስ በቀስ ብርሃን (0-5 ደቂቃ, B 25%; 5-25 ደቂቃ, B 25% -65%); የማወቅ ሞገድ 215 nm; ፍሰት መጠን 1 ml / ደቂቃ; የአምድ ሙቀት 45 ° ሴ; የመርፌ መጠን 10 μL. ውጤቶቹ በሰንጠረዥ 1 ውስጥ ተጠቃለዋል ፎርሙላ F ቀላል ቅንብር ያለው እና ከተሰነጠቀ በኋላ ከፍተኛ መጠን ያለው Cagrilintide የተቀነሰ አካባቢን ያቀርባል.

Cleavage Time Optimisation

የምላሽ ጊዜ መጨመር በአጠቃላይ ምርትን ያሻሽላል ፣ ግን ረዘም ያለ ምላሽ የጎንዮሽ ጉዳቶችን አደጋ ከፍ ያደርገዋል ፣ ስለሆነም ጥሩው የቆይታ ጊዜ መወሰን አለበት። ፎርሙላ ኤፍ ክራቫጅ ኮክቴል በመጠቀም ናሙና እና ማወቂያ በ 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 እና 3.5 h በክፍል 2.2.1 ውስጥ ያለውን የአሠራር ሂደት በመከተል ለክፍለ ጊዜ ማመቻቸት ተካሂደዋል. ውጤቶቹ በተያያዙት ሴራ ውስጥ ይታያሉ. ከፍተኛው የዋና ጫፍ ንፅህና እና የተቀነሰ የካግሪሊንታይድ ከፍተኛ ቦታ በ2.0 ሰአት ተገኝቷል፣ ይህም እንደ ምርጥ የመፍቻ ጊዜ ተመርጧል።

የክላቭጅ ሙቀት ማመቻቸት

የሙቀት መጠኑ በምላሹ ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ያሳድራል። ዝቅተኛ የሙቀት መጠን ከፍተኛ የሙቀት መጠን የ peptide መረጋጋትን በሚጎዳበት ጊዜ የመቁረጥን ውጤታማነት ይቀንሳል; ስለዚህ የሙቀት ማመቻቸት ተከናውኗል. የማጣራት ሙከራዎች በሰንጠረዥ 2 በተዘረዘሩት የሙቀት መጠኖች ተካሂደዋል Formula F ኮክቴል ለ 2.0 ሰአታት ከክፍል 2.2.1 ጋር በሚጣጣሙ ሌሎች መለኪያዎች. በሰንጠረዥ 2 ላይ እንደሚታየው በ 25 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ያለው ምላሽ ከፍተኛ ከፍተኛ ንፅህና እና ከፍተኛ ቦታ ያለው Cagrilintide ሰጥቷል። ስለዚህ, 25 ° ሴ ለቀጣይ ሙከራዎች እንደ መቆራረጥ የሙቀት መጠን ተቀባይነት አግኝቷል.

ማጠቃለያ

In summary, the optimised cleavage process is described as follows: 1.0 g dried resin-bound peptide was mixed with 10 mL cleavage cocktail composed of TFA, phenol, DODT and TIS (volume ratio 90:2.5:5:2.5), and stirred at 25 °C for 2 h. The reaction mixture was filtered through a sand-core funnel. The filtrate was added dropwise into 80 mL cold diethyl ether (-20 °C), stirred for 5 min and kept standing at -20 °C for 30 min, followed by centrifugation. The supernatant was discarded, and the white precipitate was washed 3–6 times with diethyl ether and dried under reduced pressure. 325 mg white solid crude reduced peptide 1 was obtained. The synthetic yield was calculated as 38.56% according to Equation ①: Synthetic yield = (actual crude peptide mass × content / theoretical crude peptide mass) × 100% ① Content = (peak area of crude peptide / injection volume) / (peak area of reference standard / injection volume)

This study adopted the Fmoc solid-phase peptide synthesis strategy with Rink Amide AM resin as the solid support. A 2-fold amino acid excess and Oxyma/DIC coupling system were used for solid-phase assembly. Cleavage was performed using TFA/phenol/DODT/TIS cocktail (90:2.5:5:2.5, v/v) at 25 °C for 2 h to yield reduced Cagrilintide. After iodine-mediated oxidation for 0.5 h, one-step reversed-phase HPLC purification was performed on a C₄-30 nm preparative column using mobile phase consisting of acetic acid, water and acetonitrile. The overall route yield reached 26.14% with HPLC purity of 98.00%.

This work investigates the preparation process of Cagrilintide, aiming to improve reaction yield and reduce process complexity, thereby providing references for its industrial production. In further research, cell-based and in vivo activity evaluation will be carried out on the self-prepared Cagrilintide. Moreover, synthetic strategies such as dipeptide building blocks and combined solid-/liquid-phase synthesis will be explored to identify the optimal manufacturing route.