የሜላኖታን I ድፍን-ደረጃ ውህደት ዘዴ

ዳራ

ሜላኖታን 1፣ እንዲሁም አፋሜላኖቲድ በመባልም የሚታወቀው፣ ከ13 አሚኖ አሲዶች የተውጣጣ መስመራዊ ፖሊፔፕታይድ ሲሆን በፋርማሲዩቲካል ምርምር ውስጥ ጉልህ ሚና ለመጫወት የተዘጋጀ ነው። የሜላኖታን 1 ዋና የእንግሊዝኛ ስሞች ሜላኖታን-1 እና አፋሜላኖቲድ ናቸው። እንደ α-ሜላኖሳይት የሚያነቃቃ ሆርሞን α-ኤምኤስኤች ሰው ሠራሽ አናሎግ ሆኖ፣ ሜላኖታን I በerythropoietic protoporphyria ምክንያት የሚመጡ የፎቶሴንሲቲቭ መዛባቶችን ለማከም ሊያገለግል ይችላል። በአሁኑ ጊዜ፣ አብዛኛው የሜላኖታን I ምርቶች ለምርምር አገልግሎት ብቻ የተለጠፉ ሲሆን እስካሁን ድረስ ለሰው ጥቅም የታሰቡ አይደሉም። በባህላዊ የጠንካራ-ደረጃ ውህደት ውስጥ የሬንጅ ምርጫ የምርቱን ውህደት ውጤታማነት እና የመጨረሻ ንፅህናን በእጅጉ ይጎዳል።

መሰረታዊ መረጃ

የቻይንኛ ስም: ሜላኖታን 1
የእንግሊዝኛ ስም: ሜላኖታን-1
የኩባንያ ቁጥር: GT-A006
CAS ቁጥር፡ 75921-69-6
ቅደም ተከተል፡ SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
ሞለኪውላር ፎርሙላ፡ C78H111N21O19
ሞለኪውላዊ ክብደት: 1646.88

 የዝግጅት ዘዴ

አይ. የ Fmoc-Val-Amino Resin ዝግጅት

ደረጃ 1፡11.11g (5mmol) የRamage Amide AM ሬንጅ በ0.45mmol/g ተተኪ ዲግሪ እና ወደ ጠንካራ-ደረጃ ሬአክተር ይጨምሩ። ሙጫውን ለ 30 ደቂቃዎች ለማበጥ DCM ይጨምሩ እና ከዚያ ያጥፉ። በዲኤምኤፍ ሶስት ጊዜ ይታጠቡ. 20% piperidine (v/v) የያዘ የዲኤምኤፍ መፍትሄ ይጨምሩ እና ለ 5 ደቂቃዎች ምላሽ ይስጡ። ሌላ 20% ፒፔሪዲን ዲኤምኤፍ መፍትሄ ይጨምሩ እና ለ 10 ደቂቃዎች ምላሽ ይስጡ ፣ በመካከላቸው አንድ ዲኤምኤፍ ይታጠቡ። ምላሹ ከተጠናቀቀ በኋላ በዲኤምኤፍ ሶስት ጊዜ ያፈስሱ እና ያጠቡ.

ደረጃ 2፡በዲኤምኤፍ ውስጥ 5.09g Fmoc-Val-OH, 2.02g of HOBT (1-hydroxybenzotriazole) እና 2.32ml DIC (N, N'-diisopropylcarbodiimide) በዲኤምኤፍ ውስጥ በ 0 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ይፍቱ. ሙሉ በሙሉ ከሟሟ በኋላ, ድብልቁን ወደ ምላሽ አምድ ይጨምሩ እና ለ 1 ሰዓት በቤት ሙቀት ውስጥ ምላሽ ይስጡ. አሉታዊ ውጤትን በማረጋገጥ የኒንሃይሪን ምርመራን በመጠቀም የምላሽ ሂደቱን ይቆጣጠሩ። ምላሹ ከተጠናቀቀ በኋላ Fmoc-Val-amino resin ለማግኘት በዲኤምኤፍ ሶስት ጊዜ ይታጠቡ።

II. ሙሉ በሙሉ የተጠበቀው የሜላኖታን I ሬንጅ ፔፕታይድ ዝግጅት.

ደረጃ 1፡ከላይ ባለው Fmoc-Val-aminoresin ውስጥ 20% piperidine በዲኤምኤፍ መፍትሄ (የድምጽ መጠን) ይጨምሩ። ለ 5 ደቂቃዎች ምላሽ ይስጡ, ከዚያም ሌላ የ 20% ፒፔሪዲንን በዲኤምኤፍ መፍትሄ ውስጥ ይጨምሩ እና ለ 10 ደቂቃዎች ምላሽ ይስጡ. በጊዜ ክፍተት አንድ ጊዜ በዲኤምኤፍ ይታጠቡ. ምላሹ ከተጠናቀቀ በኋላ በቫኩም ስር ማድረቅ እና በዲኤምኤፍ ሶስት ጊዜ መታጠብ.

ደረጃ 2፡5.06g Fmoc-Pro-OH, 2.02g HOBT (1-hydroxybenzotriazole) እና 2.32ml DIC (N, N'-diisopropylcarbodiimide) በዲኤምኤፍ ውስጥ በ 0 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ይቀልጡ. ሙሉ በሙሉ ከሟሟ በኋላ, ድብልቁን ወደ ምላሽ አምድ ይጨምሩ እና ለ 1 ሰዓት በቤት ሙቀት ውስጥ ምላሽ ይስጡ. አሉታዊ ውጤቶች እስኪገኙ ድረስ የኒንሃይሪን ፈተናን (Kaiser test) በመጠቀም የምላሽ ሂደቱን ይከታተሉ። ሲጠናቀቅ Fmoc-Pro-Val-aminoresin ለማግኘት በዲኤምኤፍ ሶስት ጊዜ ይታጠቡ።

ደረጃ 3፡በደረጃ 2 ላይ የተገለጸውን ዘዴ በመከተል እያንዳንዱን አሚኖ አሲድ በቅደም ተከተል በሜላኖታን I ቅደም ተከተል ማጣመር። Ac-Ser(tBu) -OH መጋጠሚያ ምላሽ ከተጠናቀቀ በኋላ በዲኤምኤፍ ሶስት ጊዜ በዲኤምኤፍ (ዲክሎሜቴን) እና ሶስት ጊዜ በሜታኖል ይታጠቡ። 23.89g ሙሉ በሙሉ የተጠበቀ ሜላኖታን I ሙጫ-ታሰረ peptide ለማግኘት በቫኩም ስር ማድረቅ።

III. የሜላኖታን I ክሩድ Peptide ዝግጅት
23.89 ግ ሙሉ በሙሉ የተጠበቀው ሜላኖታን I resin-bound peptide ክብ-ታች ባለው ብልቃጥ ውስጥ ተቀምጧል። በ 0 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ 250 ሚሊ ሊትር በቅድሚያ የተዘጋጀ ክላቫጅ ኮክቴል (ከቲኤፍኤ: thioanisole: phenol: triisopropylsilane: ውሃ = 82.5: 7.5: 5: 3: 2 በጥራዝ የተዋቀረ) ቀስ በቀስ በማነሳሳት ተጨምሯል. ድብልቅው በዝቅተኛ የሙቀት መጠን ለ 0.5 ሰአታት ምላሽ ተሰጥቶታል, ከዚያም በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 2 ሰዓታት ምላሽ ይሰጣል. ከዚያም የተሰነጠቀው መፍትሄ በቫኩም ስር ተጣርቶ ነበር. ይህ መፍትሄ ቀስ በቀስ ወደ 2 ሊትር በረዶ-ቀዝቃዛ አንሃይድሬስ ዲቲል ኤተር በማነሳሳት ተጨምሯል። ድፍድፍ peptide በማጣራት ተለይቷል, በበረዶ ቀዝቃዛ ዲቲል ኤተር ሶስት ጊዜ ታጥቧል, እና 8.55 ግራም ሜላኖታን I ክሩድ peptide ተገኝቷል.

IV. የሜላኖታን I የተጣራ Peptide ዝግጅት
ደረጃ 1፡ድፍድፍ ሜላኖታን I peptide በ 100 ሚሊር የተጣራ ውሃ ውስጥ ይቀልጡት እና ድፍድፍ የፔፕታይድ መፍትሄ ለማግኘት በ 0.45 ማይክሮን ሽፋን ውስጥ ያጣሩ።

ደረጃ 2፡ከፍተኛ አፈጻጸም ያለው ፈሳሽ ክሮማቶግራፊ (HPLC) በመጠቀም ድፍድፍ ሜላኖታን I peptideን ያጽዱ። የDAC-HB50 ተለዋዋጭ የአክሲያል መጭመቂያ አምድ በሞባይል ደረጃ A (0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution) እና የሞባይል ደረጃ B (0.05% trifluoroacetic acid in acetonitrile) ይጠቀሙ። ለመለያየት እና ለማጥራት የግራዲየንት elution ያከናውኑ። የአልትራቫዮሌት ማወቂያን በመጠቀም ናሙናውን ያግኙ እና ክፍልፋዮች ውስጥ ከታቀደው ጫፍ ጋር የሚዛመደውን የፔፕታይድ መፍትሄ ይሰብስቡ።

ደረጃ 3፡ከ HPLC ንፅህና በኋላ 180 ሚሊ ሜትር የሜላኖታን I trifluoroacetate መፍትሄ ከ 99% በላይ የሆነ ንፅህናን ያግኙ. በ rotary evaporation አማካኝነት መፍትሄውን ወደ 50 ሚሊ ሊትር ያተኩሩ.

ደረጃ 4፡የክሮማቶግራፊን አምድ በዲዮኒዝድ ውሃ ማመጣጠን እና 50 ሚሊ ሜትር የተጣራውን የሜላኖታን I trifluoroacetate መፍትሄ (ንፅህና> 99%) ይጫኑ. በ 2% አሴቲክ አሲድ የውሃ መፍትሄ ስርዓት ውስጥ ለ 50 ደቂቃዎች ይውጡ። የተሰበሰበውን የታለመውን ምርት በ rotary evaporation በኩል ወደ 80 ሚሊ ሊትር ያተኩሩ። በመጨረሻ 5.33 ግ ሜላኖታን I የተጣራ peptide ለማግኘት ፣ 32.33% ምርት ለማግኘት ቅድመ-ቀዝቃዛ ማድረቅ እና በረዶ-ማድረቅ ያካሂዱ።